Подбор, селекционирование и отработка режимов культивирования вакцинных штаммов вирусов крупного рогатого скота для конструирования вакцин

Накопление вирусной массы для изготовления вирусвакцин обычно осуществляется на первично трипсинизированных культурах клеток почки эмбриона теленка или тестикул бычка, а в последние годы - на перевиваемых культурах клеток (ПТ-линия «Таурус», МДБК, ПТ-80). В качестве питательных культуральных сред применяют среду 199, 0,5 %-ный лактальбумина гидролизат, среду Игла, ферментный гидролизат мышечных тканей (ФГМС). При производстве вакцин для накопления вирусной массы нами были использованы перевиваемые культуры клеток ПТ-линия «Таурус», МДБК, ПТ-80, которые адаптировали к 5 %-ному гемогидролизату, изготавливаемому на предприятии «Диалек» («Белбиофарм» Республики Беларусь). Данная питательная среда в 3-4 раза дешевле указанных выше, однако по своим питательным свойствам не уступает им.

Выделение и селекционирование вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. Для конструирования живых вакцин против ИРТ КРС в Республике Беларусь и странах СНГ с 1970-х годов используются аттенуированные штаммы ТК-А и MBA 2/81, а для конструирования инактивированных - 4016, Оренбург и Молдавский.

В процессе работы нами было исследовано 48 образцов материала от больных коров и телят из различных хозяйств Республики Беларусь, в результате чего было выделено 5 наиболее активных изолятов вируса ИРТ КРС.

Одновременно была проведена работа по адаптации референтных штаммов вируса ИРТ КРС ТК-А и MBA 2/81, Молдавский и выделенных изолятов на перевиваемых клеточных линиях, адаптированных к 5 %-ному гемогидролизату. Кроме того, было проведено 12 пассажей каждого вируса на четырех клеточных линиях. В результате установлено, что испытанные нами перевиваемые культуры можно с успехом использовать для накопления вирусной массы при конструировании вакцины (табл. 1.49).

Таблица 1.49. Инфекционные титры отдельных штаммов вируса ИРТ при их репродукции на различных культурах клеток (1g ТЦДзо/мл)

Особенно высокий инфекционный титр установлен при культивировании вируса ИРТ на перевиваемых клетках МДБК (до 6,5-7,0 1g ТЦДзо/мл). Характерно, что вирус, имеющий наибольшую инфекционную активность, -это штамм MBA 2/81. Исходный его титр на культуре клеток МДБК составлял 4,0 1g ТЦДзо/мл, но через 12 пассажей он достиг 7,5 1g ТЦД50/МЛ. Титр вируса ИРТ штамма ТК-А был несколько ниже и через 12 пассажей достиг 7,0 1g ТЦД50/ мл. Эпизоотические штаммы (Молдавский и изоляты из хозяйств Беларуси) имели более низкие инфекционные титры - от 4,5 до 6,0 1g ТЦД50/МЛ.

В дальнейшей работе нами использован адаптированный и аттенуированный штамм MBA 2/81, который депонирован в Республиканской коллекции микроорганизмов (ему присвоен номер КМИЭВ-6).

Для идентификации ДНК вируса и подтверждения его специфичности в отделе биотехнологии Института Сибири и Дальнего Востока РАСХН нами проведено типирование ДНК в ПЦР. На рис. 1.23 представлены результаты постановки ПЦР штамма КМИЭВ-6 вируса ИРТ в сравнении со штаммами ТК-А и Оренбург.

Рис. 1.23. Постановка ПЦР с различными штаммами вируса ИРТ

Выделение и селекционирование вируса диареи крупного рогатого скота. Для конструирования живых вакцин против вируса диареи КРС в Республике Беларусь и странах СНГ используются аттенуированный штамм ВК-1 № 28, а для конструирования инактивированных - Орегон С-24.

В процессе работы нами исследовано 54 образца материала от больных коров и телят из различных животноводческих хо

зяйств Республики Беларусь и отобрано три наиболее активных изолята вируса диареи КРС. Проведено по 12 пассажей каждого вируса на четырех клеточных линиях. В результате установлено, что исследованные нами перевиваемые культуры можно с успехом использовать для накопления вирусной массы при конструировании вакцины против вирусной диареи КРС (табл. 1.50).

Таблица 1.50. Инфекционные титры отдельных штаммов вируса диареи при их репродукции на различных культурах клеток (lg ТЦД?о/мл)

Из табл. 1.50 видно, что наиболее высокий инфекционный титр установлен при культивировании вируса диареи на перевиваемых клетках МДБК (до 5,5-8,0 1g ТЦДзо/мл). Наибольшую инфекционную активность имел вирус штамма ВК-1. Исходный его титр на культуре клеток МДБК составлял 4,2 1g ТЦД50/МЛ, но через 12 пассажей - 8,0 1g ТЦД50/МЛ. Титр вируса диареи штамма Орегон С-24 В был несколько ниже и через 12 пассажей достигал

Рис. 1.24. Постановка ПЦР с различными штаммами вируса диареи

7,5 1g ТЦД50/МЛ. Эпизоотические штаммы-изоляты из хозяйств Беларуси имели самый низкий инфекционный титр - от 5,5 до 7,0 1g ТЦД50/МЛ.

В дальнейшей работе нами использован адаптированный и аттенуированный штамм ВК-1, который депонирован в Республиканской коллекции микроорганизмов (ему присвоен номер КМИЭВ-7).

Для идентификации генома вируса диа-

реи ВК-1 и подтверждения его специфичности

в отделе биотехнологии

Института Сибири и Дальнего Востока РАСХН нами проведено типирование нуклеиновой кислоты в ПЦР.

На рис. 1.24 представлены результаты постановки ПЦР штамма вируса диареи КМИЭВ-7 в сравнении с положительным и отрицательным контролями.

Выделение и селекционирование вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота. При изготовлении вакцин против ПГ-3 КРС в Республике Беларусь и странах СНГ используются аттенуированные штаммы ПТК-45, SF-4, Бе-лорусский-9.

Нами исследовано 52 образца материала от больных ОРЗ телят из животноводческих хозяйств Республики Беларусь и отобрано два наиболее активных изолята вируса ПГ-3 КРС. В течение 12 пассажей проведена адаптация этих образцов и референтных вирусов к четырем клеточным системам с использованием в качестве питательной среды 5 %-ного гемогидролизата. В результате установлено, что испытанные перевиваемые культуры клеток можно с успехом использовать для накопления вирусной массы при конструировании вакцины против ПГ-3 КРС (табл. 1.51).

Таблица 1.51. Инфекционные титры отдельных штаммов вируса парагриппа-3 при их репродукции на различных культурах клеток (1g ТЦД50/МЛ)

Из табл. 1.52 видно, что наиболее высокий инфекционный титр уста

новлен при культивировании вируса ПГ-3 на перевиваемых клетках МДБК (до 5,0-7,5 1g ТЦД50/МЛ). Наибольшую инфекционную активность имел штамм вируса ПТК-45. Исходный его титр на культуре клеток МДБК составлял 4,5 1g ТЦД50/МЛ, но через 12 пассажей он возрастал до 7,5 1g ТЦД50/МЛ. Титр вируса ПГ-3 штамма SF-4 В был несколько ниже и через 12 пассажей составлял 7,0 1g ТЦД50/МЛ. Эпизоотические изоляты из хозяйств Беларуси имели самый низкий инфекционный титр - от 5,0 до 6,0 1g ТЩЦо/мл.

В дальнейшей работе нами использован адаптированный и аттенуированный штамм вируса ПГ-3 ПТК-45, который депонирован в Республиканской коллекции микроорганизмов (ему присвоен номер КМИЭВ-8).

12 3 4

Рис. 1.25. Постановка ПЦР со штаммом вируса парагриппа-3 КМИЭВ-8. Маркеры - стандартные олигонук-леотидные праймеры вируса парагриппа-3: / - РНК из вируса парагриппа-3 КМИЭВ-8; 2-культура клеток МДБК; 3 - отрицательный контроль; 4 - положительный контроль

Для идентификации генома вируса ПГ-3 и подтверждения его специфичности в отделе вирусологии Белорусского государственного ветеринарного центра с помощью тест-системы фирмы ФГБУ «ВНИИЗЖ» нами проведено типирование нуклеиновой кислоты вируса в ПЦР.

На рис. 1.25 представлены результаты постановки ПЦР штамма вируса ПГ-3 КМИЭВ-8 в сравнении с положительным и отрицательным контролями.

Выделение и селекционирование ротавируса крупного рогатого скота. Для конструирования вакцин против ротавирусной инфекции КРС используются эпизоотические штаммы ротавирусов 243, Белорусский-7.

В процессе работы нами исследовано 76 образцов материала от больных энтеритами телят из животноводческих хозяйств Республики Беларусь. В результате выделено и отобрано 4 наиболее активных изолята ротавируса - Р-7, Р-11, Р-44, Р-48. Проведена адаптация их и референтных вирусов к различным клеточным системам: перевиваемым линиям почек зеленой мартышки - Vero, почки эмбриона коровы - ПЭК, почки теленка - МДВК, почки поросенка - СПЭВ. Клетки были адаптированы к 5 %-ному гемогидролизату. Результаты 12 пассажей каждого вируса на указанных клеточных линиях показали, что эти перевиваемые культуры можно с успехом использовать для накопления вирусной массы при конструировании вакцины против ротавирусной инфекции КРС (табл. 1.52).

Таблица 1.52. Инфекционные титры отдельных штаммов ротавируса при их репродукции на различных культурах клеток (1g ТЦДзо/мл)

Как видно из табл. 1.52, наиболее высокий инфекционный титр установлен при культивировании ротавируса на перевиваемых клетках СПЭВ (до 5,0-7,5 lg ТЦДзо/мл). Наибольшую инфекционную активность имел вирус штамма 243. Исходный его титр на культуре клеток СПЭВ составлял 4,0 lg ТЦД50/МЛ, а через 12 пассажей титр достиг 7,5 lg ТЦД50/МЛ. Титр ротавируса штамма Белорусский был несколько ниже и через 12 пассажей составлял 7,0 lg ТЦД50/ мл. Эпизоотические изоляты из хозяйств Беларуси имели наиболее низкий инфекционный титр - от 4,5 до 7,0 lg ТЦД50/МЛ.

В дальнейшей работе нами использован адаптированный штамм ротавируса 243, который депонирован в Республиканской коллекции микроорганизмов (ему присвоен номер КМИЭВ-3).

Для идентификации генома ротавируса и подтверждения его специфичности в отделе вирусологии Белорусского государственного ветеринарного центра с помощью тест-системы фирмы ФГБУ «ВНИИЗЖ» нами проведено типирование нуклеиновой кислоты вируса в ПЦР.

1 2 3

Рис. 1.26. Постановка ПЦР с ротавирусом крупного рогатого скота.

Маркеры - стандартные оли-гонуклеотидные праймеры ротавируса. 1 - РНК из ротавируса КМИЭВ-3; 2 - отрицательный контроль; 3 - положительный контроль

На рис. 1.26 представлены результаты постановки ПЦР штамма ротавируса КМИЭВ-3 в сравнении с положительным и отрицательным контролями.

Выделение и селекционирование коронавируса крупного рогатого скота. Для конструирования вакцин против коронавирусной инфекции КРС используются в основном эпизоотические штаммы коронавирусов F-17 и Белорусский-11.

В процессе работы нами исследовано 73 образца материала от больных энтеритами телят из животноводческих хозяйств Республики Беларусь. В результате отобрано 4 наиболее активных изолята коронавируса - КР-4, КР-19, КР-33, КР-41. Проведена их адаптация к новым клеточным системам: перевиваемым линиям клеток почек зеленой мартышки - Vero, почки эмбриона коровы - ПЭК, почки теленка - МДБК, почки поросенка — СПЭВ. Клетки были адаптированы к 5 %-ному гемогидролизату.

Проведено по 12 пассажей каждого вируса на четырех клеточных линиях. Исследования показа

ли, что вышеуказанные перевиваемые культуры клеток можно с успехом использовать для накопления вирусной массы при конструировании вакцины против коронавирусной инфекции КРС (табл. 1.53).

Таблица 1.53. Инфекционные титры отдельных штаммов коронавируса при их репродукции на различных культурах клеток (1g ТЦДго/мл)

Из табл. 1.53 видно, что особенно высокий инфекционный титр установлен при культивировании коронавируса на перевиваемых клетках МДБК (до 5,0-6,0 1g ТЦДзо/мл). Наибольшую инфекционную активность имели штаммы F-17 и Бело-русский-4. Хотя исходный их титр на культуре клеток составлял 4,0 1g ТЦД50/ мл, однако через 12 пассажей он увеличился до 5,5-6,01g ТЦД50/МЛ. Эпизоотические штаммы из хозяйств Беларуси имели более низкий инфекционный титр - до 4,5 1g ТЦД50/МЛ.

В дальнейшей работе нами использован адаптированный штамм коронавируса Белорусский-4, который депонирован в Республиканской коллекции микроорганизмов (ему присвоен номер КМИЭВ-1).

1 2 3

Рис. 1.27. Постановка ПЦР с коронавирусом крупного рогатого скота.

Маркеры - стандартные олигонукле-отидные праймеры коронавируса.

• 1 - РНК из коронавируса КМИЭВ-1;
• 2 - отрицательный контроль;
• 5 - положительный контроль

Для идентификации генома коронавируса и подтверждения его специфичности в отделе вирусологии Белорусского государственного ветеринарного центра с помощью тест-системы фирмы ФГБУ «ВНИИЗЖ» нами проведено типирование нуклеиновой кислоты вируса в ПЦР.

На рис. 1.27 представлены результаты постановки ПЦР коронавируса КМИЭВ-3 в сравнении с положительным и отрицательным контролями.

Авторы: Ковалев Н.А., Красочко П.А.