ДНК-ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ЯРОВОГО ЯЧМЕНЯ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ПЫЛЬНОЙ ГОЛОВНЕ МЕТОДОМ ПЦР

Аннотация. Целью наших исследований являлась идентификация сортообразцов, несущих гены, кодирующие устойчивость к головневым болезням ячменя. При проведении исследований использовался новый метод - ДНК-генотипирование на основе ПЦР с применением определенных маркеров. В процессе проводимых исследований были протестированы более 80 сортообразцов из питомника ТатНИИСХ. Для проведения ПЦР были применены два маркера, определяющие устойчивость к пыльной головне (Un8-700R и Un8-700S). В результате работы были определены хозяйственно-ценные генотипы для дальнейшего использования их в селекционной работе.

Введение. Наиболее экономичным и экологически безопасным способом контролирования болезней ячменя является использование устойчивых сортов растений. Применение молекулярных маркеров, связанных с генами устойчивости к болезням, предопределяют огромные возможности, будучи использованными в качестве инструментов селекции для селекционеров.

Экономически важные признаки сельскохозяйственных культур характеризуются множеством показателей, контролируемых определенными генами и их аллелями. Один из разделов современной генетики, имеющий название функциональной геномики, позволяет идентифицировать гены, контролирующие важные селекционные признаки растений, и в том числе устойчивость к болезням и качественные показатели зерна. Суть данной технологии заключается в использовании диагностических маркеров для проведения молекулярно-генетической диагностики, которая дает возможность отобрать генотипы растений с желаемыми признаками. Это направление получило название маркер-вспомогательной селекции.

В настоящее время довольно хорошо разработана генетика устойчивости ярового ячменя к болезням. Во многих случаях она определяется одним геном. Большинство генов устойчивости к пыльной головне (Un) доминантны. По данным исследователей, были определены 8 генов, определяющих различную степень устойчивости к видам головни [1, 3]. Один из них, Un8, определяет устойчивость к наиболее известным расам пыльной головни U. nuda [2] и является геном, представленным в геноме большинства устойчивых сортов ярового ячменя [3]. Другой ген Ruh определяет устойчивость к расам покрытой головни U.hordei [4].

Целью наших исследований являлась идентификация сортообразцов, несущих гены, кодирующие устойчивость к пыльной головне ячменя. В работе применялся метод ДНК-

генотипирования на основе ПЦР с применением определенных маркеров.

Условия, материал и методы исследования. Материалом исследования служили сор-тообразцы из питомника ТатНИИСХ. В качестве материала для исследования использовались 7-10 дневные проростки, полученные в результате проращивания семян в термостате при температуре 25°С в течение 1 недели. Для исследований отбиралась зеленая часть проростка (листья), из которой выделялась ДНК.

Экстракция геномной ДНК осуществлялась набором для выделения ДНК из растительного материала «ДНК-Сорб-С» в соответствии с методологией, предоставленной производителем набора.

Молекулярно-генетическая оценка сортообразцов ярового ячменя на предмет идентификации генотипов, несущих гены устойчивости к пыльной головне, проводилась методом ПЦР с использованием соответствующих серий праймеров по протоколам, разработанным авторами. При необходимости протоколы модифицировали для достижения нужного эффекта. Объем реакционной смеси составлял 20 мкл. Амплификацию ДНК проводили в термоциклерах MyCycler BioRad, США. Для достоверности полученных данных ПЦР проводили 3 раза. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле в буфере ТВЕ (pH 8,0), содержащем этидий бромид с последующей визуализацией результатов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (Х=310 нм). В качестве маркеров длины фрагментов ДНК использовали маркеры молекулярной массы 100 Ьр + 50 bp DNA Ladder производства ООО «СибЭнзим-М», Москва.

Данные, полученные в результате ДНК-диагностики гибридных популяций отобранными маркерами, сравнивались между собой. Эти же маркеры использовались для генотипирования образцов из коллекции ТатНИИСХ, которые использовались в качестве исходного материала для проведения селекционной работы. В качестве положительных контрольных образцов использованы растенияСЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ НАУКИ

Таблица 1 - Маркеры, сцепленные с геном устойчивости к пыльной головне ячменя

Рис. 1. Электрофореграмма ПЦР-идентификации локуса UN8-700S (сорт Раушан) Примечание: Яркая полоса 714 Ьр свидетельствует о наличии гена восприимчивости к пыльной головне

Рис.З. Продукты амплификации, полученные с использованием праймера Un8-700S Примечание: полоса 714 Ьр свидетельствует о наличии гена восприимчивости к пыльной головне (образцы 1,3,5.7,8,9.11)

Рис. 2. Электрофореграмма ПЦР-идентификации локуса UN8-700S (сорт Раушан) Примечание: Яркая полоса 716 Ьр свидетельствует о наличии гена устойчивости к пыльной головне

Рис.4. Продукты амплификации, полученные с использованием праймера Un8-700R Примечание: полоса 716 Ьр свидетельствует о наличии гена устойчивости к пыльной головне (образцы 1,7,9,10)

доноры устойчивости (сорта ярового ячменя с заявленными генами устойчивости к пыльной головне).

Анализ и обсуждение результатов. В процессе проводимых исследований были протестированы 83 сортообразца, отобранные в питомнике ТатНИИСХ. Для идентификации гена U8 использовались два SCAR-маркера устойчивости к пыльной головне - Un8-700R и Un8-700S (Табл. 1). При использовании этих маркеров для проведения ПЦР у сорта Раушан селекции ТатНИИСХ наблюдалось наличие характерных фрагментов размером 714 и 716 Ьр (рис. 1 и 2)

Проведенное ДНК-генотипирование показало, что количество гомозиготных линий по устойчивости к головневым болезням было относительно небольшим (Рис. 3, 4).

В результате проведенных исследований было обнаружено, что 36,2% (37 образцов) имеют в геноме аллели гена, кодирующего восприимчивость к пыльной головне (Рис. 5). Всего лишь 5,3% (пять сортообразцов) отлича-

отсутствие генов устойчивости/ восприимчивости

гомозиготные линии по восприимчивости к пыльной головне

гомозиготные линии по устойчивости к пыльной

головне

гетерозиготные линии

Рис. 5. Распределение генов устойчивости/ восприимчивости у сортообразцов селекции

лись присутствием в геноме аллелей гена устойчивости Un8, три из которых (линии К-192-01, К-383-11 и 2409-1Т) оказались гомозиготными по гену устойчивости к пыльной головне (Табл. 2).

У линий К-411-11 и 2401-01 присутствуют аллели обоих генов, у остальных сортообразцов наблюдается отсутствие гена устойчивости к пыльной головне.

Сравнение с данными учета распространения пыльной головни, предоставленными отделом селекции ячменя, показало отсутствие зараженности линий К-192-01, К-383-11, 2904-1Т, К-411-11 и 2401-01 пыльной головней на естественном инфекционном фоне, что является дополнительным подтверждением присутствия гена Un8 в геноме выделенных генотипов.

Табл. 2. Молекулярно-генетическая оценка некоторых сортообразцов ярового ячменя по генам устойчивости/восприимчивости к пыльной головне

Примечание: «+» - наличие гена; «-» - отсутствие гена

Литература

• 1 .Ardiel, G.S. Inheritance of resistance to covered smut in barley and development of a tightly linked SCAR marker / G.S. Ardiel, T.S. Grewal, P. Deberdt, B.G. Rossnagel, G.J. Scoles // Theor Appl Genet - 2002. - V. 104 -P. 457-464.
• 2. Grewal, T.S. Mapping of a covered smut resistance gene in barley (Hordeum vulgare) / T.S. Grewal, B.G. Rossnagel, G.J. Scoles // Can. J. Plant Pathol. - 2004. - V. 26 - P. 156-166.
• 3. Grewal, T.S. Identification of resistance genes to barley covered smut and mapping of the Ruhl gene using Ustilago hordei strains with defined avirulence genes / T.S. Grewal, B.G. Rossnagel, G. Bakkeren, G.J. Scoles // Can. J. Plant Pathol. - 2008. - V. 30 - P. 277-284.
• 4. Grewal, T.S. Validation of molecular markers for covered smut resistance and marker-assisted introgression of loose and covered smut resistance into hulless barley / T. S. Grewal, B.G. Rossnagel, G.J. Scoles // Mol Breeding -2008,-V. 21-P.37-48.
• 5. Eckstein, P.E. Development of PCR-based markers for a gene (Un8) conferring true loose smut resistance in barley / P.E. Eckstein, N. Krasichynska, D. Voth, S. Duncan, B.G. Rossnagel, G.J. Scoles // Can. J. Plant Pathol. -2002.-V. 24-P. 46-53.
• 6. Chelkowski, J. Resistance genes in barley (Hordeum vulgare L.) and their identification with molecular markers / J. Chelkowski, M. Tyrka, A. Sobkiewicz // J. Appl. Genet. - 2003. - V. 44(3) - P. 291-309.
• 7. Menzies, J.G. A resistance gene to Ustilago mida in barley is located on chromosome 3H / J.G. Menzies, B.J. Steffenson, A. Kleinhofs // Can. J. Plant Pathol. - 2010. - V. 32(2) - P. 247-251.

Выводы и рекомендации. Таким образом, по результатам молекулярно-генетической оценки с целью идентификации генотипов, устойчивых к головневым болезням, проведенной в 2013 году, были определены пять сортообразцов из питомника ТатНИИСХ, имеющих в геноме аллели генов устойчивости

к пыльной головне, а именно: К-192-01, К-383-11, 2904-1Т, К-411-11 и 2401-01. Эти сор-тообразцы являются перспективными для дальнейшего использования в селекционной работе и могут быть рекомендованы как ценные генотипы для селекции по признаку устойчивости ячменя к пыльной головне.

• 8. Metcalfe, D.R. Inheritance of loose smut resistance. III. Relations between the “Russian” and “Jet” genes for resistance and genes in 10 barley varieties of diverse origin / D.R. Metcalfe // Can. J. Plant Sciences - 1966. - V.46 _ P.487-495.
• 9. Metcalfe, D.R. Inheritance of resistance to loose smut, covered smut and false loose smut in the barley variety Jet I Can. J. Plant Sciences - 1962. - V.42 - P. 176-189.
• 10. Терещенко, H.A. Хромосомная локализация генов устойчивости к пыльной головне ячменя. / Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук. Москва - 2001.