Определение биологической ценности белков масличных семян

Белки семян, поступающих на хранение и технологическую переработку, не содержат в своем составе полного набора незаменимых аминокислот. Условия хранения семян, продолжительность хранения до переработки, температурные условия послеуборочной обработки, а также другие факторы способны заметно снизить биологическую ценность белков семян, а также уменьшить их усвояемость организмом человека и животных.

Определение относительной биологической ценности белков микрометодом (метод с инфузорией Тетрахимена пириформис) [9]. Под биологической ценностью понимают степень удерживания азота, поступающего с пищей, в растущем организме или эффективность его утилизации при поддержании азотного равновесия в организме, которая зависит от аминокислотного состава белков и их структурных особенностей. Определение биологической ценности белков может производиться различными методами, в основе которых лежат либо установление скорости роста организма, либо определение степени задержки азота в организме, либо контроль азотистого баланса и способность к регенерации тканей.

Биологическую ценность белков независимо от принципа определения или метода расчета выражают не в абсолютных, а в относительных величинах (%), сравнивая с аналогичными показателями стандартных белков. В качестве стандартного принят белок цельного куриного яйца или белок коровьего молока (казеин).

Экспериментальное определение относительной биологической ценности белковых веществ может быть проведено не только на высших животных, но и на микроскопических инфузориях тетрахимена пириформис (Tetrachymena pyryphormis').

Определение относительной биологической ценности белковых продуктов проводят по методике, разработанной А.Д. Игнатьевым с сотрудниками.

Инфузория тетрахимена пириформис имеет двойной цикл пищеварения: кислотный и щелочной. Многие ее ферментативные системы адекватны ферментным системам высших животных, и для ее роста требуются все незаменимые аминокислоты. Общие черты жизнедеятельности высших животных и Tetrachymena pyryphormis обусловили ее широкое применение в качестве тест-объекта при изучении обмена веществ, роста и питания животных. Быстрый рост в благоприятных условиях и микроскопические размеры инфузории Tetrachymena pyryphormis позволяют получать за короткое время статистически достоверные данные, совпадающие с экспериментальными данными исследований, проводимых на высших животных.

Метод основан на учете числа инфузорий, размножившихся за определенное время в одинаковых условиях при добавлении в пищу стандартного белка (казеина) и испытуемой пробы, содержащей определенное количество азота. Результаты выражают в процентах от стандартного белка.

Для выполнения анализа потребуются следующие реактивы и оборудование: растворы А, Б, В; раствор глюкозы, дрожжевой экстракт, культура инфузории, основной раствор Люголя, микробиологические пробирки, ватно-марлевые пробки, весы аналитические, штатив для пробирок, водяная баня, термостат (25 °С), счетная камера Горяева, ступки с пестиком, микроскоп МБИ.

Приготовление растворов:

• - раствор А: 7 г MgSCU ^х 7Н₂О растворить в 50 мл дистиллированной воды, 3,125 г Fe(NH4)₂ ^х (SO4>2 растворить в 50 мл воды, 31,3 мг МпС1₂ ^х 4Н₂О растворить в 50 мл воды, 12,5 мг ZnCl₂ растворить в 100 мл воды. По 1 мл полученных растворов солей смешать в мерной колбе и довести объем смеси до 10 мл дистиллированной водой;
• -раствор Б: 453 мгСаС1₂, 60 мг СиС1₂ ^х 2Н₂О, 15 мг FeCh ^х 6Н₂О растворить раздельно, затем слить вместе и довести объем дистиллированной водой до 200 мл;
• - раствор В: 1,75 г КН₂РО4 и 1,7 г К₂НРО4 растворить в 100 мл воды;
• -дрожжевой экстракт'. 1 г дрожжей растворить в 100мл воды непосредственно перед проведением анализа;

• - раствор глюкозы. 15 г глюкозы растворить в 100 мл воды;
• - по 1 мл растворов А, Б и В смешать и довести объем до 10 мл дистиллированной водой;
• -основной раствор', смешать 10 мл растворов А, Б, В, раствора глюкозы и дрожжевого экстракта, установить pH 7,1 титрованием 0,1 н. раствора NaOH;
• - среда для культивирования тест-кулътуры (г/100 мл): бактериологический пептон — 2, дрожжевой экстракт — 0,1, глюкоза — 0,5, хлорид натрия — 0,1; казеин, концентрированная культура Tetrachymena pyryphormis в 5 %-м растворе глюкозы (pH 7,1), трехсуточная культура Tetrachymena pyryphormis.

Испытуемые пробы белковых продуктов и стандартный казеин растереть в ступках до размеров частиц не более 200 нм.

В сухие и чистые пробирки поместить навески (в трех повторностях) испытуемых белковых продуктов и параллельно в другие пробирки — контрольные навески стандартного казеина из расчета 0,4 мг/г общего азота. В пробирки добавить 0,4 мл основного раствора и 0,5 мл дистиллированной воды.

Пробирки в штативе термостатировать при 85 °С в течение 15-20 мин для инактивации посторонней микрофлоры. После охлаждения пробирок до комнатной температуры произвести посев 0,02 мл трехдневной культуры tetrachymena pyryphormis и затем термостатировать при 25 °С в течение 4 сут, периодически встряхивая пробирки (через 3-6 ч).

По окончании термостатирования содержимое пробирок фиксировать раствором Люголя, взять пробу суспензии и произвести подсчет микроорганизмов в счетной камере Горяева.

Расчет.

Относительная биологическая ценность (ОБЦ) белковых продуктов, % (16):

ОБЦ = К_б^х 100/К_к,

(16)

где Кб — количество микроорганизмов, выросших в опытных пробирках с исследуемым белковым веществом; К_к — количество микроорганизмов, выросших в контрольных пробирках с казеином.

Определение синильной кислоты в продуктах гидролиза нитрилглюко-зидов семян льна и фруктовых косточек. Синильная кислота входит в состав циан, или нитрилглюкозидов, которые содержатся в семенах льна и плодовых фруктовых косточках. В семенах льна она является составной частью цианглюко-зида-линамарина, в плодовых косточках — цианглюкозида-амигдалина.

Под действием ферментов гликозидаз в семенах льна и в плодовых косточках — линамарин и амигдалин — в присутствии воды гидролизуются, высвобождая синильную кислоту. Методика определения синильной кислоты в семенах и жмыхах льна и плодовых косточках основана на ферментативном гидролизе циан- или нитрилглюкозидов, содержащих в семенах или жмыхах и на титровании высвободившейся синильной кислоты азотнокислым серебром по методу Либиха.

Определение массовой доли свободной синильной кислоты. Метод основан на отгонке свободной синильной кислоты с водяным паром из материала, в котором предварительно инактивированы глюкозидазы и титрованием ее азотнокислым серебром по методу Либиха.

Для выполнения анализа потребуются следующие реактивы и оборудование: 1,5 %-й раствор КОН, 10 %-я винная кислота, 0,1 н раствор AgNOs; весы 4-го класса, колбы вместимостью 2 000, 750 и 1 000 мл, водяная баня, парообразователь, холодильник Либиха.

Около 100 г материала, измельченного до прохода через одномиллиметровое сито, взвешивают с точностью до 0,1 г на технических весах и помещают в круглодонную или плоскодонную колбу вместимостью 2 л. Затем приливают 500 мл воды, нагретой до кипения для инактивации ферментов, и 50 мл 10 %-го водного раствора винной кислоты для подкисления содержимого колбы.

Колбу с содержимым ставят иа нагретую водяиую баню и быстро соединяют с парообразователем и холодильником Либиха. К холодильнику Либиха присоединяют приемную колбу на 750—1 000 мл с 25-30 мл 1,5 %-го раствора КОН. Отгонку синильной кислоты паром производят при одновременном нагревании колбы с содержимым на кипящей водяной бане. Во время отгонки трубка, подводящая пар в колбу, и конец форштоса холодильника должны быть погружены в жидкость. После получения 400-500 мл дистиллята отгонку прекращают.

Количество синильной кислоты в дистилляте определяют титрованием его 0,1 н. раствором AgNCh.

При прибавлении по каплям раствора AgNO.3 к щелочному раствору KCN, образовавшему при взаимодействии HCN с КОН, в месте падения капель образуется белый осадок AgCN, исчезающий при взбалтывании жидкости. AgCN растворяется в избытке щелочного раствора KCN с образованием серебряно-синеродистого калия по уравнению:

AgCN + KCN Ag (CN)₂ К.

Таким образом один ион Ag взаимодействует с двумя ионами CN. Как только весь CN превратится в серебряно-синеродистый калий, следующая за этим капля AgNO₃ дает неисчезающий белый осадок:

Ag (CN)₂ К + AgNO₃ -> KNO₃ + 2 Ag CN.

После этого титрование заканчивается.

Массовую долю синильной кислоты в % (X) определяют по формуле (17):

(Т х V х 0,318 х 100) / Т* (17)

где Т — титр раствора AgNO₃; V — количество миллилитров раствора AgNO₃, израсходованное на титрование дистиллята; 0,318 — коэффициент, выражающий отношение удвоенного молекулярного веса HCN к молекулярному весу AgNO₃; Р- навеска материала в г.

Расхождения между параллельными определениями не должны превышать 0,002 %.